PEWARNAAN BASIL TAHAN ASAM

A.    PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM (BTA)

           Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).

            Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin, alkohol asam, dan methylen blue. Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu positif 1 dan positif 2 yang dilaporkan secara kuantitatif menurut IUAT, yaitu:

Negatif : apabila tidak ditemukan BTA.
Positif : apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang.

            Tujuan pemberian carbol fuchsin 0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Tujuan pemberian alkohol asam 3% adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam 0,3% karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak hilang. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna background (Pelczar dan Chan, 1986).

            Mewarnai bakteri yang tahan terhadap asam digunakan cara pewarnaan Ziehl Neelson. Pewarnaan Ziehl Neelson terdapat beberapa perlakuan dan zat kimia yang diberikan. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri. Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya (Pelczar dan Chan, 1986).

Reagensia        : Larutan Zat warna karbol  fukhsin

Larutan Hc1 Alkohol

Oil imersi

Methylen blue

Ø  Alat – alat       : 

1.      Mikroskop

2.      Ose bulat

3.      Objek glass

4.      Bunsen

5.      Hand skun

6.      Masker

7.      Pingset

8.      Paper lens

9.      Tissue

Ø  Cara kerja :

1.      Mula – mula ambil mikroskop dilemari dengan seksama, kemudian letakkan diatas meja dengan hati – hati

2.      Buka iris diafrogma, kemudian atur cahaya

3.      Ambil objek glass dan dengan bersihkan dengan alcohol agar bebas dari lemak

4.      Beri etiket dan lingkari objek glass dengan spidol permanen kira -  kira 1 – 2cm dibelakang objek glass

5.      Oles sampel sputum diatas objek glass dan keringkan pada suhu kamar

6.      Fixasi diatas api selama 3x berturut – turut

7.      Teteskan karbol fukhsin kuat pada sediaan sambil diuapkan selama 5 menit. Lalu bilas menggunakan aquadest

8.      Kemudia tetesin Hc1 alkohol pada sediaan. Lalu tunggu selama 30 detik kemudian bilas dengan aquadest

9.      Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama 2 menit lalu bilas menggunakan auadest.

10.  Tunggu sampai kering dan periksa dibawah mikroskop dengan menggunakan imersi dan pembesaran 100 x.

Ø  Hasil pengamatan :

Pewarna BTAada 4 macam

1.      Pewarna ziehl Neelsen

2.      Pewarna kinyoun

3.      Gabbett

4.      Tan tiam hok

Ø  Yang termasuk bakteri tahan asam (BTA)

1.      Mycobacterium tuberculosis

2.      Mycobacterium leprae

3.      Saprolphil usus

I.    Cara ZIEHL NEELSEN.

Larutan-larutan yang diperlukan :

A.  Carbol-fuchsin : Basic fuchsin          : 1 gram.

                                 Alkohol 95%           : 10 ml.

                                 Phenol 5% dlm air   :100 ml.

Mula-mula fuchsin dilarutkan dalam alkohol (gerus dalam mortir), kemudian tambah phenol, biarkan 24 jam, saring.    

B.   Alkohol-asam, yaitu 3-5 ml asam chlorida pekat dalam alkohol 95% sampai 100 ml.

C.   Methylen biru biasa, sebagai counter stain.

Methylen biru : 1 gram.

Aquadest       : 100 ml.

Dapat juga digunakan methylen biru menurut Loffler.

Caranya :

1.      Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian disiram dengan carbol-fuchsin.

2.      Panasilah sediaan itu dengan hati-hati sampai kelihatan uap tetapi jangan sampai mendidih, biarkan menguap kira-kira 3-5 menit.

3.      Cuci dengan aquadest kemudian warna carbol-fuchsin dibuang dengan decolorisasi HCl-alkohol.

4.      Pencucian selesai bila air cucian tidak berwarna merah lagi, cuci lagi dengan aquadest.

5.      Warnai dengan counter stain methylen biru, biarkan kira-kira 2-3 menit. (Loffler m. blue 20-30 det).

6.      Cuci dengan air, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.

Ø  Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah.

Tidak tahan asam    : biru.

II.   Cara KINYOUN. (Am. J. Pub. Health th 5: 867, 1915).

A.    Larutan Carbol-fuchsin menurut Kinyoun : Basic fuchsin 4 gram, alkohol 95% 20 ml, phenol 8 gram, dan aquadest 100 ml. Fuchsin digerus dalam mortir dengan alkohol sampai larut.Cucilah berkali-kali mortir itu dengan air dan pindahkan ke dalam botol. Panasilah phenol di atas penangas air 56°C sampai mencair dan tambahkanlah phenol itu ke larutan tadi.Biarkan 24 jam, kemudian disaring dan siap untuk dipakai.

B.     Decolorisasi : HCl 3-5% atau Asam-sulfat 5%.

C.     Counter stain : Methylen biru 1% dalam air.

Caranya :

1.      Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian fiksasi di atas api.

2.      Tuangi dengan larutan Kinyoun, biarkan 3-5 menit.

3.      Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.

4.      Tetesi dengan asam-sulfat 5%, biarkan : ½ menit.

5.      Bubuhi dengan alkohol 70%, biarkan : ½ menit.

6.      Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.

7.      Warnai dengan methylen biru, biarkan : 1 menit.

8.      Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.

9.      Cara Kinyoun tidak perlu dipanasi.

Ø  Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah 
Tidak tahan asam    : biru.

III.   Cara GOBBET.

A.    Buat preparat, keringkan dan fiksasi di atas api, kemudian tuangi dengan basic-fuchsin yang terdiri dari : basic fuchsin 0,9 gram, alkohol 95% 10 ml, phenol 5% 90ml, panasi sampai keluar uap dan biarkan selama 3-5 menit.

B.     Bersihkan dengan air kran mengalir pelan-pelan ½ menit.

C.     Celupkan ke dalam larutan Gobbet selama 1 menit. Larutan Gobbet terdiri dari : Methylen biru 1 gram, asam-sulfat 96% 20 ml, alkohol absolut 30 ml dan aquadest 50 ml.

D.    Bilasi dengan air kran, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.

Ø  Hasil pewarnaan:

Bakteri tahan asam  : merah.

Tidak tahan asam    : biru.

IV.    Cara TAN THIAM HOK.

Cara ini merupakan kombinasi dari Kinyoun dan Gabbet.

1.    Sediaan sesudah difiksasi di atas api, celupkan ke dalam larutan Kinyoun selama 3 menit.

2.    Cuci dengan air kran selama ½ menit.

3.    Celupkan lagi dalam larutan Gabbet selama 1 menit.

4.    Bilasi dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar dan dilihat dengan mikroskop.

Ø  Hasil pewarnaan:

Basil tahan asam : merah.

Tidak tahan asam : biru muda.

*HASIL PEWARNAAN

DAFTAR PUSTAKA

1.      Jutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM.

2.      Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.

3.      Pelzar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of Mycrobiology. New York: Mc grow-Hill Book Company.

4.      Sechlegel, H. G. And Schimt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : UGM Press.

5.      Staf pengajar FKUI, 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Binawa Aksara.

6.      Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI Press.